Nata a Napoli il 18 febbraio 1986, Alessandra Mastronardi si trasferisce a Roma all’età di cinque anni con la famiglia. Si diploma al liceo classico e si iscrive successivamente al corso di laurea in Discipline dello Spettacolo presso l'Università La Sapienza della capitale. Debutta nel 1997 nella fiction tv Un prete tra noi, seguito dalla seconda stagione di Amico mio (1998) e da Lui e lei 2 (1999). Dopo una piccola comparsa ne Il manoscritto di Van Hecken (1999), ricopre il ruolo di una commessa ne La bestia del cuore (2003) di Cristina Comencini. Nello stesso anno la vediamo anche in Prova a volare (2003), al fianco di un giovanissimo Riccardo Scamarcio. Eccola poi nella fortunata serie Un medico in famiglia, in un episodio della terza stagione a vestire i panni di una studentessa ribelle. Arrivano poi le esperienze de Il veterinario (2005), Il grande Torino (2005) e in una puntata della quinta serie di Don Matteo (2006). La svolta della sua carriera arriva certamente con il ruolo di Eva Cudicini nella serie I Cesaroni (2006) di Francesco Vicario. Mentre continua l'impegno con questa fiction di successo, la Mastronardi debutta a teatro con la commedia "The Prozac Family" diretta da Marco Costa. Eccola poi in Romanzo criminale - La serie (2008) di Stefano Sollima, mentre nel 2012 è Clelia nella miniserie televisiva di Cinzia TH Torrini, La Certosa di Parma. Nello stesso anno è protagonista della fiction Titanic - Nascita di una leggenda e compare nel cast del film To Rome with love di Woody Allen.
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